Slovenská zdravotnícka univerzita

I. Genetické minimum  - chromozómové choroby a ich diagnostika

Ďurovčíková Darina

Klinika lekárskej genetiky SZU a FNsP, Bratislava

Úvod

Genetické choroby vznikajú v dôsledku mutácii na úrovni  génu, alebo väčšej časti  genómu, v interakcii s exogénnymi faktormi. Výskyt  geneticky podmienených patologických stavov ( tab.1), alebo predispozícia k nim sa podľa viacerých štatistík odhaduje na 12-15%  (1,2).

Etiologickú rôznorodosť spôsobujú  rôzne typy  genetických   defektov,   detekcia ktorých si vyžaduje špecifické   laboratórne  metódy (tab.1).   V ostatnom čase sme zaznamenali ich významný pokrok, týkajúci sa najmä rozvoja genetických diagnostických testov, ktoré majú priamy dopad na manažment komplexnej starostlivosti o pacientov a rizikových členov rodiny. Pre včasnú  diagnostiku a prevenciu genetických ochorení je dôležité vzdelávanie a transfer poznatkov  do praxe každého lekára. Potrebe  začlenenia najnovších poznatkov z medicínskeho výskumu a genetiky do pregraduálneho a  postgraduálneho vzdelávania  sú venované osobitné príspevky na blížiacej sa konferencii AMEE (Association of Medical Education in Europe). Forsíruje  sa dostupnosť  vedomostí  s cieľom  rozpoznať  genotypo-fenotypové  korelácie najmä  vo vzťahu k liečbe a celkovej zdravotnej starostlivosti (3).  Iné asociácie a spoločnosti (ESHG, OECD) odporúčajú   vzdelávanie v uvedených oblastiach vrátane genomiky a proteomiky  zaradiť aj do  mimoprofesného vzdelávania pracovníkov v zdravotníctve ako aj  pre širokú  laickú verejnosť. Primeraná úroveň vzdelania  zbavuje neopodstatnených obáv z genetiky, ktorá je v 21.storočí  neoddeliteľnou súčasťou liečebno-preventívnej starostlivosti.

S potešením možno konštatovať, že uvedené  odporúčania u nás viac rokov  akceptujeme. Otázky genetického testovania, algoritmy genetickej diagnostiky, správnej laboratórnej praxe, etiky a legislatívy v odbore sú  náplňou  pravidelných školiacich aktivít na SZU.

Zároveň sú pre nás ambíciou zaplniť priestor v tomto periodiku na pokračovanie, ktorého obsahom bude  minimum genetických poznatkov. Prvú časť  venujeme chromozómovým ochoreniam a prehľadu ich diagnostických metód.

I. Chromozómové choroby

Chromozómové anomálie pozorujeme ako zmeny na chromozómoch , ktoré môžu byť :

-          vrodené (konštitučné)

-          získané (v priebehu života napr. malígnym procesom v bunke).

Vrodené chromozómové anomálie spôsobujú zmenou počtu, alebo štruktúry chromozómov  génovú nerovnováhu a upozornia na seba závažnou poruchou morfogenézy. Pre autozómové anomálie je typický výskyt VVCH spolu s mentálnou retardáciou (obr.1). Anomálie pohlavných chromozómov  sprevádzajú poruchy rastu a somatosexuálneho vývinu a sú z klinického hľadiska menej závažné. Vyhľadávanie ich zvýšeného  rizika sa uskutočňuje  celoplošným  prenatálnym biochemický skríningom ( sAFP a betaHCG ) u tehotných žien v rozmedzí 16-18 týždňa gravidity. Vrodené a získané chromozómové anomálie potvrdíme  cytogenetickým vyšetrením  pri ktorom sa  stanoví karyotyp. Výskyt chromozómových chýb  v populácii živorodených je  cca 1% (2.4).

Diagnostické známky  na klinickej úrovni

Na chromozómové ochorenia u novorodenca upozorňuje prítomnosť vrodených vývinových chýb (VVCH) , ktoré sú zastúpené v ich etiológii cca 5%. Signálmi pre chromozómovú anomáliu bývajú  nevysvetliteľná polystigmatizácia, tonusové poruchy, rôzne patologické parametre zistené prenatálnym ultrazvukovým vyšetrením plodu  ako sú: mikrocefalia, zhrubnutá nuchálna riasa, rastová retardácia a rôzne orgánové anomálie a iné. Neskôr to býva mentálna retardácia, zaostávanie rastu, pubertálneho vývinu, nástupu menštruácie a iné.  V dospelosti sa konštitučná chromozómová anomália  diagnostikuje skôr výnimočne. Ich záchyt pozorujeme  pri vyšetrení párov pre poruchy   fertility a reprodukcie v podobe anomálií  pohlavných chromozómov, zriedkavých foriem malých gonozómových mozaík a vyvážených chromozómových prestávb.

Charakteristika a rozdelenie

Predstavujú odchylky od normálnej chromozómovej výbavy somatickej bunky, ktorá obsahuje 22 párov autozómov (1-22 )  a pár pohlavných chromozómov – gonozómov (XX, alebo XY). Najčastejšou príčinou vzniku aneuploidie je nondisjukcia, alebo patologické rozdelenie chromozómov v meióze, ktoré  vzniká prezygoticky. Zriedkavo sú dôsledkom postzygotickej poruchy mitotického  bunkového delenia. Tieto javy sú väčšinou náhodné,  aj keď sa pripúšťa, že  určité rodiny môžu mať sklon k nondisjuncii (asynchrónne delenie pri predčasnom delení centroméry). Len istá malá časť chromozómových anomáli vzniká zákonite v dôsledku   vyvážených anomálií (prestavieb chromozómov), ktoré sa vyskytujú  v populácii ich zdravých prenášačov   s frekvenciou menej ako 0,2% (4)

Rozdelenie  podľa (I a II)  zohľadňuje typy chromozómov a konkrétne zmeny.

I. Rozdelenie podľa typu chromozómov

A./     AUTOZÓMOVÉ                 

B./     GONOZÓMOVÉ

II. Podľa typu zmien v  počte a štruktúre chromozómov:         

a/ numerické - odchýlky od normálneho  počtu diploidnej sady chromozómov somatickej bunky. Môže ísť nadpočetný chromozóm z páru ( trizómia ), chýbajúci ( monozómia ), dva nadpočetné chromozómy z páru ( tetrazómia ) , násobky sady chromozómov  ( triploidie ) a  iné  odchylky od normálneho počtu (aneuploidie ). Z autozómových anomálií k nim patrí trizómia 21 - Downov syndróm. Ide o najčastejšiu chromozómovú anomáliu, ktorej výskyt populácii je od  od 1:750-1000 živorodených. Medzi ďaľšie   zvyčajne neonatálne letálne trizómie patria  Patauov ( trizómia 13 ) a Edwardsov ( trizómia 18 ) syndróm.

Trizómia môže byť voľná, náhodná forma s nízkym rizikom rekurencie, alebo translokačná. Táto mohla vzniknúť ako mutácia de novo, alebo  dôsledkom vyváženej translokácie jedného z rodičov.   Z gonozómových anomálií má najčastejší výskyt  monozómia X, alebo Turnerov ( karyotyp 45,X0 ) a Klinefelterov syndróm ( karyotyp 47,XXY), ktoré sa zisťujú v čistej, alebo mozaikovej forme. Výskyt  vybraných chromozómových anomálií je v tabuľke č.2.

b/ štruktúrové -  charakterizuje zmena štruktúry chromozómu vizualizovateľné ako prestavby krátkeho (p) a / alebo  dlhého ramienka (q) chromozómu. Patria sem chýbanie  určitého úseku chromozómu (delécia), alebo zmnoženie (duplikácia) istého úseku  chromozómu. Ďalej sú to premiestnenie časti chromozómu  na iný (translokácia), alebo iné tvarové zmeny chromozómov ( prstencový chromozóm, izochromozóm). Príkladom autozómovej štruktúrovej  anomálie je syndróm mačacieho plaču (Cri-de-Chat sy ), ktorý spôsobuje delécia úseku krátkeho ramienka chromozómu č.5 (obr.2)  Zjednodušený zápis karyotypu u chlapca  s týmto syndrómom je 46,XY, 5p-. Z gonozómových anomálií sa pomerne často vyskytuje prstencový chromozóm X - karyotyp 45,X r(X), alebo izochromozóm, ktorý sa u ženy manifestuje ako Turnerov syndróm (5).  Submikroskopické zmeny, kryptické translokácie nie sú možné touto metódou obsiahnúť.

c/ mozaiky: predstavujú prítomnosť viacerých bunkových klonov s rozdielnou chromozómovou výbavou. Pozorujeme ich v bunkách ako rôzne chromozómové línie, nezriedka ako minoritné,  s frekvenciou menšou ako  10%. Na ich detekciu je potrebné zhodnotiť väčšie množstvo mitotických figúr. Časté sú  napríklad mozaikové formy Turnerovho syndrómu, Klinefelterovho syndrómu. U týchto pacientov teda nájdeme v bunkách karyotyp s normálnym a patologickým  chromozómovým nálezom. Zápis karyotypu obsahuje viacero línii a začína sa zvyčajne najpočetnejšie zastúpenou. Mozaika Turnerovho syndrómu môže mať aj takýto nezvyčajný karyotyp ( 45,XO/46,XX/46,XY ). V tomto prípade prevažuje línia s  chýbajúcim X chromozóm, prítomná je aj normálna a minoritná s prítomnosťou Y chromozómu. Existujú aj iné varianty s prstencovým, alebo s izochromozómom.

Genetické diagnostické testy

Chromozómové anomálie najčastejšie  diagnostikujeme laboratórnymi technikami, ktoré poskytujú kompletnú analýzu  karyotypu. V ostatnom čase sa klasické metódy identifikácie chromozómov dopĺňajú o nové zobrazovacie metódy, ktorými sa odhaľujú predtým nepoznané prestavby na submikroskopickej úrovni (5,6).

Klasická  metóda cytogenetického vyšetrenia je založená na analýze  metafázových chromozómov získaných mitotickým delením   kultivovaných  lymfocytoch, ktoré sa farbia  konvenčne  a prúžkovacími metódami  (C, G, R, Q). Detekuje numerické  a štruktúrové anomálie  na úrovni  do 550 bandov. Vyššiu rozlišovaciu schopnosť dosiahneme metódou HRT (High resolution method), kde sa hodnotia dlhšie  prometafázické chromozómy. Vyšetrenie karyotypu  touto  metódou  vyžaduje  odbornú  skúsenosť  a pre jej náročnosť ju  nahrádzajú iné modernejšie  metódy farebnej cytogenetiky (6).

Klasická cytogenetika sa rutinne  využíva v diagnostike konštitučných chromozómových anomálií u pacientov s vrodenými vývinovými chybami (VVCH), mentálnou retardáciou ( MR ),  poruchami rastu a pohlavného vývinu, alebo pri  opakovaných spontánnych potratov. V neposlednej rade aj v prenatálnej diagnostike u plodu, ktorá sa uskutočňuje po  stanovení ich rizika klinickým genetikom. Gonozómové anomálie, najmä v nizkopercentnej  mozaikovej forme (Turnerov, Klinefelterov syndróm) sa môžu výnimočne  diagnostikovať  až pri poruchách reprodukcie v dospelom veku.   Klasická metóda umožní záchyt štruktúrových anomálií a mnohonásobných chromozómových prestávb, ktoré sú typické pre  syndrómy chromozómovej instability  s rizikom malignity. Príkladom  sú Fanconiho anémia,  Ataxia teleangiektázia, Nijmegenský syndróm a iné. Manifestujú sa zvýšenou lomivosťou chromozómov. Najčastejšie sa pri týchto syndrómov zistí  instabilná chromozómová translokácia 7/14, spolu s inými štruktúrovými zmenami a figúrami ( gapy, breaky, triradiály, kvadruradiály), ktoré bývajú v rôznom percentuálnom zastúpení (obr.3).

Fluorescenčná in situ  hybridizácia ( FISH ) metóda   používa metódy molekulovej cytogenetiky. Umožní diagnostiku chromozómových   prestávb na submikroskopickej úrovni   ( < 800 bandov ), ktoré nie  sú  vizualizovateľné klasickou technikou . Ide najmä o mikrodelečné a mikroduplikačné syndrómy  a  pomáha tiež odhaliť  nízkopercentné mozaiky. Princípom je  detekcia signálov po hybridizácii pacientovej chromozómovej DNA   so  špecifickými sondami   (centromerickými, celochromozómovým, alebo  lokusovo špecifickými) použitými podľa potreby  (obr.4 ). Centromerické sondy sa používajú na zisťovanie numerických chromozómových chýb  s dôkazom  prítomnosti centromér, telomerických sekvencií a obsahu heterochromatínu. Celochromozómové sondy hybridizujú so svojim homológom pozdĺž celého chromozómu. Sú vhodné  na diagnostiku štruktúrových anomálií chromozómov ako sú translokácie, delécie,  inverzie.  Lokusovo špecifické, alebo génové sondy  hybridizujú do  oblasti  hľadaných konkrétnych  sekvencii. Tento typ sond, veľkosti cca 150 kb,  sa využíva k diagnostike mikrodelečných  syndrómov ako sú napríklad najznámejšie z nich  ( Praderov-Williho, Angelmanov, Di-Georgov, Wiliamsov-Beuerenov).  Výhodou tejto metódy je hodnotenie signálov na väčšom počte   chromozómov aj  bunkových jadier.  Použitie  FISH a iných DNA metód  detekujúcich sekvencie v oblasti SRY chromozómu Y umožňuje  pri mozaikových formách Turnerovho syndrómu  vyhľadávať pacientky  s rizikom  gonadoblastómu. 

Kombinácia klasických a molekulovo cytogenetických metód  sa využíva v  onkogenetike  pri diagnostike a   liečbe   hemoblastóz, vrátane monitorovania reziduálnej choroby a postransplantačných stavoch.   Chronickú  myeloickú  leukémiu potvrdzuje   výskyt chromozómu   Philadelphia, ktorý vzniká v dôsledku translokácie medzi dlhými ramenami 9 a 22 chromozómu. Dôsledkom je vytvorenie fúzneho proteínu BcR/Abl a jeho aktivácia. U časti pacientov túto zmenu zachytíme vyšetrením karyotypu  klasickými metódami, inokedy sa  detekuje metódou FISH, alebo inými molekulovými technikami.  Pre detekciu iných komplikovaných chromozómových prestavieb sa používajú metódy multicolor FISH a komparatívna genómová hybridizácia  ( CGH ).  Onkocytogenetické vyšetrenie pri hemoblastózach  sa v súčasnosti  uskutočňuje s pomocou viacerých sond ( panelu ), ktorý prispieva k potvrdeniu a klasifikácii typu leukémie.   Typ prestavby  chromozómov môže byť  súčasne aj prognostickým markerom choroby. Čoraz častejšie sa tieto metódy využívajú aj pri vyšetrení solídnych tumorov u detí.

Iné modifikované techniky

CGH - Komparatívna genómová hybridizácia  je založená na porovnávaní dvoch fluorescenčne značených vzoriek  DNA ( referenčnej a pacientovej), ktoré hybridizujú s normálnymi metafázovými chromozómami. Pacientová testovaná DNA je značená zeleným flurochrómom a referenčná vzorka ( DNA od zdravého jedinca s normálnym karyotypom ) sa označuje červeným. V pomere 1:1 sa obidve  nechajú hybridizovať na preparáte s normálnymi chromozómami. Nerovnováhu v testovanej vzorke   zistíme vyhodnotením pomeru intenzity zelenej a červenej fluorescencie   pomocou špeciálneho softwaru. Využíva sa v nádorovej cytogenetike na skrínovanie chromozómovej nerovnováhy. Metóda však presnejšiu identifikáciu prestavby neumožňuje.

Multicolor FISH- mnohonásobná farebná fluorescentná in situ hybridizácia  K detekcii zmien  sa používa zmes rozdielne značených sond  5 fluorochrómami a ich  vzájomnou kombináciou, čím sa docieli  rozlíšenie  všetkých chromozómov. Na vyhodnotenie je potrebná digitálna zobrazovacia mikroskopia s filtrami, CCD kamera a počítačový software k analýze obrazu. Na základe fluorochrómovej kompozície sa každému chromozómu určí tzv.pseudofarba..Táto metóda sa používa na identifikáciu zložitejších translokácií a prestavieb  medzi viacerými chromozómami. Neumožňuje detekciu vnútrochromozómových zmien  typu inverzií a malých delécií.

SKY - spektrálne karyotypovanie  je variantom mnohofarebnej FISH, každému chromozómu je tiež pridelená pseudofarba. Kombinuje  snímanie obrazu  trojakým filtrom  CCD kamerou  s Fourierovou spektroskopiou a príslušným počítačovým programom.

mBAND - metóda mnohonásobného pruhovania - je založená na podobnom princípe ako FISH. Podstatou m.-pruhovania je označenie jedného chromozómu viacerými značenými sondami. V kombinácii sa tiež používa 5 fluorochrómov. Každá sonda hybridizuje s inou časťou chromozómu. Na základe  hybridizačných signálov dochádza k tvorbe   priečnych farebných pruhov po celej dĺžke chromozómu.

 Záver: Zlatým štandardom klinickej cytogenetiky je vyšetrenie karyotypu klasickou metódou. S pribúdajúcimi dôkazmi o výskyte submikroskopických chromozómových zmien,  kryptických prestávb modernými laboratórnymi technikami sa zvyšuje pravdepodobnosť odhaliť kauzálnu súvislosť   s etiologicky neobjasnenou mentálnou retardáciou a  polystigmatizáciou.  

Literatúra:

1.  Smith, C. J., Donnai , D.: Human malformation.  In:   Emery and Rimon´s  Principles and Practice of Medical Genetics. 3.vyd. New-York:  Churchill Livingstone, 1998,  s.  687 - 696.

2.  Thompson and  Thompsonová : Genetics in medicine, W.B.Saunders company, 6-th Ed., 2001, s.443.

3.  Internetové  adresy:  www.amee.org

4.  VOGEL, F.,  MOTULSKY,  A.G.  Human Genetics.  3. vyd .Berlin-Heidelberg:  Springer - Verlag , 1997, s 370 -376 .

5.  Izakovič V. a kolektív: Cytogenetika v klinickej endokrinológii., Osveta Martin, 1972, 320 s.

6.  Černáková I., Ďurovčíková D., Brozmanová, M.: De novo tandem duplication 15q21-26 identified  by FISH. Cytogenet.Cell. Genet.,Vol.85,1999, Suppl.1., s.144

Tab.1  Geneticky podmienené patologické stavy

           Chromozómové   ( 0,6 – 0,9 %) 

           Monogénové   ( 0,8% )

           AD, AR, X-viazané

           Multifaktoriálne ( polygénne dedičné)

            a/ izolované  VVCH ( 3-5% )

            b/ choroby dospelého veku   ( 5% )

           Genetické poruchy somatických buniek

           Mitochondriálne  dedičné

       ____________________________________________

          Celkový výskyt v populácii živorodených  : 12 -15%                                                      

Tab. 2  Populačná frekvencia  chromozómových syndrómov

               (  na 1000 živorodených )